Come identificare un batterio

Contenuto

• stadi
• Metodo 1 Identificare un batterio con la colorazione di Gram
• Metodo 2 Eseguire il test di colorazione Ziehl-Neelsen
• Metodo 3 Studia il comportamento e l'aspetto dei batteri
• Metodo 4 Interpretazione di tutti i risultati

In questo articolo: Identificazione di un batterio mediante colorazione di Gram Eseguire il test di colorazione di Ziehl-Neelsen Studiare il comportamento e l'aspetto dei batteri Interpretazione di tutti i risultati43 Riferimenti

L'identificazione dei batteri è un compito complesso. Uno dei motivi è che, secondo le stime, ci sono tra le 10.000 e 1 miliardo di specie batteriche nel mondo! Identificare correttamente i batteri è molto importante, specialmente in campo medico, dove il trattamento adeguato di una malattia dipende in gran parte dal tipo di microbo che causa il problema. Nella maggior parte dei casi, l'identificazione viene effettuata sulla base dell'eliminazione. Per identificare un batterio, è necessario eseguire test di colorazione, analizzarne l'aspetto e osservare come risponde bene alle diverse condizioni. Se hai bisogno di un risultato rapido, preleva un campione di DNA da inviare a un laboratorio.

stadi

Metodo 1 Identificare un batterio con la colorazione di Gram

1. determinare se i batteri sono Gram positivi o negativi. La colorazione di Gram è un metodo di divisione dei batteri tra i due tipi più comuni: Gram positivo e Gram negativo. I primi hanno una spessa parete cellulare costituita da un polimero chiamato peptidoglicano, che presenta la migliore colorazione rispetto alle pareti sottili dei batteri Gram-negativi.
   • Alcuni tipi comuni di batteri Gram-positivi sono streptococchi, stafilococchi, micrococchi (o micrococchi) e listeria.
   • Ecco alcuni esempi comuni di batteri Gram-negativi: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium e Campylobacter.
2. Adottare le misure di protezione appropriate. I batteri e gli elementi chimici che utilizzerai durante il test rappresentano un rischio per la tua salute. Indossare occhiali protettivi, guanti monouso in nitrile e un camice da laboratorio durante l'esecuzione del test di colorazione. Una volta finito, metti i guanti e tutti gli altri materiali contaminati in una borsa speciale. Ricordarsi di seguire le procedure del proprio laboratorio per eliminare la borsa per i prodotti contaminati.
3. Metti il ​​campione da osservare su un vetrino. Per iniziare il test, posizionare una goccia o un campione batterico su un vetrino sterile. Quindi, far scorrere la lama su un bruciatore Bunsen acceso tre volte per fissare il campione e impedire che esca dalla piastra quando si risciacqua o si aggiungono i reagenti.
4. Aggiungi 5 gocce di cristallo viola alla lama. Versare cinque gocce di una soluzione di cristallo viola sul campione. Attendere un minuto affinché il campione assorba il viola cristallo.
   • Tieni la lama in posizione con mollette per non macchiarti le mani.
5. Lavare accuratamente la lama per rimuovere la macchia. Utilizzare un rubinetto o una bottiglia per spremere e far scorrere l'acqua molto lentamente per un massimo di cinque secondi per rimuovere i residui di inchiostro che non hanno aderito al campione.
6. Versare cinque gocce di una macchia di diodi Gram sulla diapositiva. È una soluzione composta da diodo, bicarbonato di sodio e dioduro di potassio che fa sciogliere il violetto cristallino con le pareti cellulari dei batteri. Versare cinque gocce della soluzione sul campione e lasciare in posa per un minuto.
7. Lavare il campione con alcool o acido lattico. L'alcool e il lacetone sono agenti sbiancanti ed eliminano la colorazione delle pareti cellulari batteriche se sono Gram-negativi. Versare alcune gocce di candeggina sul campione e lasciarlo agire per non più di tre secondi. Successivamente, prova a sciacquare delicatamente con acqua per cinque secondi per rimuovere questi agenti sbiancanti.
   • Se si lascia che la candeggina funzioni a lungo, si può verificare la scomparsa della colorazione batterica Gram-positiva, con conseguente falso negativo.
8. Eseguire un test di contrasto con la safranina. La safranina è una tintura rossa che contrasta con il viola cristallo, colorando così i batteri non influenzati dalla colorazione viola. Versare circa cinque gocce di safranina sul campione e lasciare in posa per un minuto. Successivamente, prova a sciacquare delicatamente con acqua per cinque secondi.
9. Visualizza il tuo campione con ingrandimento 1000X. I batteri diventeranno viola o viola se sono Gram positivi o rosa se Gram negativi a causa della safranina.

Metodo 2 Eseguire il test di colorazione Ziehl-Neelsen

1. Utilizzare questa tecnica per rilevare batteri acido-resistenti. Queste specie contengono una maggiore quantità di lipidi, rendendole più resistenti ai coloranti utilizzati nella colorazione di Gram. I batteri resistenti agli acidi appartengono al genere Mycobacterium, che comprende il batterio responsabile della tubercolosi (M. tuberculosis). Per tingere un batterio resistente agli acidi, è necessario utilizzare un colorante rosso chiamato fucsina carbolica, resistente al risciacquo con soluzioni acide o solforiche.
2. Adottare le misure di protezione appropriate. I materiali chimici e biologici utilizzati durante la colorazione di Ziehl-Neelsen possono essere pericolosi. Inoltre, dovrai anche utilizzare fonti di calore, come un ugello Bunsen, una stufa elettrica o una lampada ad alcool. Seguire le istruzioni seguenti per eseguire il test.
   • Indossare occhiali, guanti in nitrile e un camice da laboratorio.
   • Fare attenzione a non inalare i vapori di coloranti e candeggina e non lasciare che le goccioline schizzino gli occhi o la pelle. Tenere i contenitori aperti sotto un cofano.
   • Prestare molta attenzione durante il riscaldamento della lama. La maggior parte dei prodotti chimici utilizzati sono infiammabili. Ci possono anche essere tracce di sostanze infiammabili sulle diapositive o altre attrezzature.
3. Preparare la lama. Con movimenti circolari, distribuire uniformemente una piccola quantità del campione batterico al centro di un vetrino sterile. Il campione deve occupare circa 10 mm per 20 mm.
4. Asciugare la lama. Posizionare la lama sulla struttura di essiccazione con il campione rivolto verso l'alto. Lascia asciugare naturalmente per 30 secondi. Non tentare di asciugare la lama con un panno.
5. Fissare il campione con il calore. Con il campione rivolto verso l'alto, far scorrere la lama due o tre volte su un bruciatore Bunsen acceso. È inoltre possibile posizionare la lama su una stufa elettrica impostando la temperatura tra 65 ° C e 75 ° C per almeno due ore. Fare attenzione a non bollire o bruciare il campione.
6. Aggiungi la fucsina carbolica alla lama. Versare diverse gocce di questa soluzione sulla diapositiva. Versare abbastanza per coprire completamente il campione.
7. Scalda la lama per fissare il colorante. Riscalda con cura il vetrino sopra un bruciatore Bunsen o una lampada ad alcool, con il campione rivolto verso l'alto o posizionalo su una stufa elettrica. Riscaldare la lama a 60 ° C o fino a quando non inizia a rilasciare vapore. Lascia agire la tintura per cinque minuti.
   • Se si utilizza una stufa elettrica, accenderla a 60 ° C. Se opti per la lampada ad alcool o il bruciatore Bunsen, dovresti aspettarti di vedere fumi.
   • Per mantenere la lama alla temperatura desiderata per cinque minuti, riscaldarla a intermittenza.
   • Fare attenzione a non bollire, bruciare o asciugare il campione.
8. Risciacquare la lama con acqua fredda. Lascialo raffreddare per cinque minuti e risciacqua delicatamente per alcuni secondi con acqua pulita. Utilizzare acqua di rubinetto o un flacone per spremere per rimuovere le macchie di colore che non hanno aderito al campione.
9. Versare sul campione alcool acido o acido solforico. Utilizzare un volume del 3% in volume (v / v) di alcool o acido solforico al 20% per coprire completamente il campione. Lasciare agire l'acido fino a quando il colore non si attenua e raggiunge una tonalità rosa molto brillante. Il processo richiede in genere circa dieci minuti.
10. Utilizzare acqua pulita per risciacquare la lama. Lavare delicatamente la lama sotto un rubinetto o usando una bottiglia per spremere. Rimuovere bene tutti i residui di acido e colorante.
11. Aggiungi l'agente di contrasto. Dopo aver sciacquato il vetrino, versare sulla tintura di verde malachite o blu di metilene. Queste due soluzioni creano uno sfondo bluastro o verdastro su cui verrà fuori il colorante rosso, così come altri materiali biologici, come cellule umane e batteri non acidi. Lascia agire le sostanze per uno o due minuti.
12. Risciacquare e asciugare la lama. Risciacquare abbondantemente con acqua per rimuovere il contrasto in eccesso. Una volta terminato, asciugare la parte posteriore della lama con un panno asciutto e lasciarlo asciugare naturalmente su un supporto.
13. Visualizza il tuo campione con ingrandimento 1000X. I batteri resistenti agli acidi diventeranno rossi o rosa scuro. Altri batteri, cellule non batteriche e la base della lama diventeranno verdi o blu.

Metodo 3 Studia il comportamento e l'aspetto dei batteri

1. Analizza la forma dei batteri. Dopo aver eseguito il test di colorazione per determinare se i batteri sono Gram-positivi, Gram-negativi o resistenti agli acidi, è tempo di identificare le specie in modo più preciso. Innanzitutto, analizza la forma dei batteri sulla diapositiva. Le tre forme più comuni sono cocchi (sferici), spirali e bacilli (a forma di bastoncino).
   • Esistono diverse varianti di queste forme. I batteri di forma rotonda (coccus), ad esempio, possono apparire in coppie (diplococchi), in catene, in cumuli o in gruppi di quattro (tetradi).
2. Scopri se i batteri sono aerobici o anaerobici. Prelevare due campioni di batteri e creare due colture separate. La luna deve essere anaerobica (cresciuta senza ossigeno), mentre l'altra deve essere aerobica (cresciuta con ossigeno). Conservare la coltura anaerobica a 35 ° C in un luogo privo di ossigeno per almeno 48 ore prima di osservare la crescita.
   • Se i batteri crescono in un ambiente senza ossigeno, ma non quando sono esposti all'ossigeno, significa che sono anaerobici.
   • Sebbene si sviluppino in un ambiente ossigenato, ma non in assenza di ossigeno, sono aerobici.
   • Quando si sviluppano in entrambi gli ambienti, parliamo di batteri anaerobici facoltativi.
3. Eseguire un test di motilità. Un batterio è mobile se può muoversi da solo con uno o più flagelli. Il grado di motilità è molto importante nell'identificazione di alcune specie batteriche. Esistono diversi tipi di motilità, ma il modo più sicuro e più leggibile è il mezzo semisolido.
4. Crea una cultura per il test di motilità. Preparare una coltura di batteri in un brodo di coltura. Segui le istruzioni qui sotto per preparare il brodo che preferisci.
5. Inoculare la coltura in un agar semi-solido per i test di motilità. Rivestire una parte della coltura del brodo con un ago sterile per inoculazione. Piantare con cura l'ago nel tubo dagar semisolido, come il TTC lagar, che è stato preparato per il test. L'ago deve penetrare per 2/3 dell'agar.
   • Al termine, rimuovere con cura l'ago, facendo attenzione a non superare i limiti della zona di inoculazione.
   • Incubare la provetta a 30 ° C per 48 ore.
6. Leggi il risultato del test. L'agar per il test di motilità diventa rosso al contatto con i batteri. Se sono mobili, questa sfumatura rossa o rosata si diffonderà in tutta la sostanza. In caso contrario, la colorazione sarà limitata al sito di iniezione.

Metodo 4 Interpretazione di tutti i risultati

1. Raccogli i tuoi commenti. Per conoscere il tipo di batteri, dovrai raccogliere le informazioni ottenute dalle colture, i test di colorazione e l'osservazione delle forme. Se si esaminano i campioni di un paziente, i sintomi che presentano possono anche aiutare a determinare il tipo di batteri appropriato.
   • Ad esempio, se i test mostrano che i batteri sono gram-negativi, anaerobici, non mobili e si notano sintomi come dolore addominale, nausea e vomito nel paziente, è probabile che il paziente soffra di infezione da Bacteroides. fragilis.
2. Consultare un database Ci sono migliaia di specie di batteri nel mondo. È impossibile sapere tutto a memoria. Probabilmente dovrai consultare un libro di microbiologia clinica o un database online per confrontare i risultati dei test con le informazioni sulle specie batteriche.
   • Esistono eccellenti risorse online per identificare i batteri, ma la maggior parte di questi database sono disponibili in inglese, inclusi Patricbrc.org e GlobalRPh. Tuttavia, è ancora possibile trovare informazioni utili sul sito web del Centro internazionale di risorse microbiche INRA.
3. Fai un test genetico per conoscere l'esatta specie di batteri. In alcuni casi, potrebbe essere necessario identificare le specie batteriche. Il metodo più rapido e semplice è eseguire un test del DNA. I test del DNA sono utili anche per identificare i batteri resistenti alle forme tradizionali di colorazione e coltura. Al giorno d'oggi, i test del DNA sui microrganismi sono molto veloci e possono essere pronti in meno di due ore.
   • Se non si ha accesso a un laboratorio che esegue il sequenziamento genetico di microrganismi, inviare un campione batterico a un'agenzia specializzata.